端粒是真核生物染色體末端的特異DNA-蛋白結(jié)構(gòu),端粒DNA是一系列重復(fù)的富含G的DNA序列,這一序列在生物進化中有高度的保守性(人重復(fù)序列為TTAGGG)。已確認端粒在保護基因組DNA不被降解、防止染色體有害的結(jié)合(如染色體末端融合、重排、染色體移位和染色體缺失)中起重要作用。
由于DNA聚合酶不能復(fù)制線性DNA的zui末端,多數(shù)正常體細胞的端粒末端每經(jīng)一個復(fù)制循環(huán)就進行性縮短。這一現(xiàn)象在體內(nèi)和體外都得到證實,并且可能與真核生物的正常體細胞有限的繁殖能力有關(guān)。
這一活性可能在與細胞衰老有關(guān)的情況中起作用。與體細胞相對照,生殖細胞是永生性的,它需要為將來器官形成保存全部的遺傳信息。因此它必須對抗端粒縮短。這一工作通過在基因組染色體的末端添加新的端粒重復(fù)序列而完成。
端粒酶是一種核糖核蛋白,它們用自身的RNA成份的互補序列作模板,催化TTAGGG重復(fù)序列加到染色體末端。在大多數(shù)永生性細胞株和腫瘤細胞株中也可見端粒酶活性的表達。端粒酶反應(yīng)超越了細胞的增殖限制,這可能是惡性腫瘤發(fā)生的一個先決條件。
傳統(tǒng)的端粒酶研究方法是以探針延伸為基礎(chǔ)測定端粒酶活性。由于需要大量的樣品材料,且檢驗靈敏度受局限,這一方法已被端粒重復(fù)擴增法(omeric Repeat Amplification Protocol,TRAP)所取代。
標準的TRAP測定是通過PCR擴增端粒酶反應(yīng)的產(chǎn)物,使用放射性標記,經(jīng)凝膠電泳后,通過放射自顯影顯示結(jié)果。
這里介紹使用非放射性標記的檢測端粒酶的新方法:活性光密度酶聯(lián)免疫測定法。這種方法具有如下特點:
安全,無需使用放射性同位素
一步反應(yīng),使用即用的混合物使端粒酶介導(dǎo)的引物延伸和PCR擴增可在一個試管中進行。
應(yīng)用廣泛,擴增后可適用于不同分析法。
靈敏,與放射性同位素TRAP測定相當(dāng)。
可靠,準確、重復(fù)性好。
快速,6-8小時得到結(jié)果。
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